Javascript è attualmente disabilitato nel tuo browser.Diverse funzionalità di questo sito non funzioneranno mentre javascript è disabilitato.libero accesso alla ricerca scientifica e medicaRiviste scientifiche e mediche peer-reviewed ad accesso aperto.Dove Medical Press è un membro dell'OAI.Ristampe di massa per l'industria farmaceutica.Offriamo vantaggi reali ai nostri autori, inclusa l'elaborazione rapida dei documenti.Registra i tuoi dettagli specifici e i farmaci specifici di interesse e abbineremo le informazioni fornite agli articoli dal nostro ampio database e ti invieremo prontamente copie PDF via e-mail.Torna a Riviste » International Journal of Nanomedicine » Volume 17Autori Navarro-Palomares E, García-Hevia L , Galán-Vidal J , Gandarillas A, García-Reija F, Sánchez-Iglesias A, Liz-Marzán LM, Valiente R , Fanarraga MLPubblicato il 28 novembre 2022 Volume 2022:17 Pagine 5747—5760DOI https://doi.org/10.2147/IJN.S381628Revisione tramite singola peer review anonimaEditor che ha approvato la pubblicazione: Prof. Dr. Anderson Oliveira LoboElena Navarro-Palomares,1 Lorena García-Hevia,1 Jesús Galán-Vidal,2 Alberto Gandarillas,2 Fe García-Reija,3 Ana Sánchez-Iglesias,4,5 Luis M Liz-Marzán,4,5 Rafael Valiente,1, 6 Mónica L Fanarraga1 1The Nanomedicine Group, Valdecilla Health Research Institute IDIVAL, Universidad de Cantabria, Santander, 39011, Spagna;2Cell Cycle, Stem Cell Fate & Cancer Laboratory, Valdecilla Health Research Institute IDIVAL, Santander, 39011, Spagna;3Unità di Chirurgia Orale e Maxillofacciale, Valdecilla Hospital HUVM, Santander, Spagna;4CIC biomaGUNE, Basque Research and Technology Alliance (BRTA), e CIBER de Bioingeniería, Biomateriales y Nanomedicina (CIBER-BBN), San Sebastián, 20014, Spagna;5Ikerbasque, Basque Foundation for Science, Bilbao, 48009, Spagna;6Dpt.Fisica Applicata, Facultad de Ciencias, Universidad de Cantabria, Santander, 39005, Spagna Corrispondenza: Mónica L Fanarraga;Lorena García-Hevia, Istituto di Ricerca Sanitaria Valdecilla IDIVAL, Università della Cantabria, Avda Herrera Oria s/n, Santander, 39011, Spagna, Tel +34 942315515 int.74101, E-mail [e-mail protetta];[email protected] Introduzione: Una grande sfida nella nanomedicina, e più specificamente nella teranostica, è migliorare la specificità, la selettività e il targeting dei nanomateriali verso i tessuti o le cellule bersaglio.L'uso topico di nanomedicine come coadiuvanti della chemioterapia sistemica può migliorare significativamente la sopravvivenza dei pazienti affetti da carcinomi localizzati, riducendo gli effetti collaterali dei farmaci tradizionali e prevenendo le recidive locali.Metodi: qui, abbiamo utilizzato la tossina Shiga, per progettare un ligando proteico sicuro e ad alta affinità (ShTxB) per legare il recettore globotriaosilceramide (GB3) che è sovraespresso sulle superfici delle cellule tumorali preneoplastiche e maligne nella testa e nel collo tumori.Risultati: Troviamo che i nanotubi d'oro funzionalizzati ShTxB sono retrotraslocati in modo efficiente nei citoplasmi cellulari GB3-positivi.Dopo 3 minuti di radiazione laser con una lunghezza d'onda risonante con il plasmone di superficie localizzato longitudinale AuNR, viene attivata la morte delle cellule tumorali mirate.Sia i modelli murini preclinici che le cellule bioptiche dei pazienti mostrano la natura non citotossica di queste nanoparticelle funzionalizzate prima dell'attivazione della luce e la loro selettività di trattamento.Discussione: Questi risultati mostrano come l'uso di nanomedicine guidate da ligandi naturali possa rappresentare un trattamento efficace per tumori localizzati aggressivi, come il carcinoma a cellule squamose del cavo orale.Parole chiave: nanomateriale funzionalizzato, ligando naturale, targeting per nanoparticelle, carcinoma squamoso, globotriaosilceramideLa nanomedicina ha inaugurato una nuova era nella somministrazione di farmaci, migliorando la stabilità e il targeting dei farmaci, riducendo al contempo la biodegradazione.Tuttavia, indirizzare i nanomateriali in modo efficiente ai tessuti e controllarne il destino intracellulare sono tra i principali problemi della nanomedicina, con conseguente scarso successo nella traduzione "dal banco al letto".Come per la chemioterapia, si stima che meno dell'1% delle nanomedicine somministrate per via sistemica raggiunga lo stroma tumorale.1-4 Pertanto, la bassa efficienza di targeting e la potenziale tossicità dei nanomateriali sono considerate un'arma a doppio taglio che ne limita l'applicazione.Per migliorare la specificità, la biocompatibilità e la selettività delle nanomedicine, i nanomateriali vengono funzionalizzati attraverso modifiche superficiali.La maggior parte delle nanoterapie in fase di sviluppo si basa sulla coniugazione di nanoparticelle con anticorpi,5 o loro frammenti,6 per il loro targeting specifico per i recettori sulle cellule tumorali, alle quali si legano con elevata affinità.7 Tuttavia, l'instabilità delle nanoparticelle, la limitata penetrazione nei tessuti, e l'incapacità di attraversare le membrane cellulari sono i principali svantaggi.8 Di conseguenza, le concentrazioni di farmaci somministrati alle cellule tumorali non raggiungono le dosi terapeutiche di soglia e possono persino generare resistenza.9 Ma, fino a quando il targeting dei nanomateriali somministrati per via sistemica non migliora, la nanomedicina potrebbe enorme potenziale nel trattamento locale dei tumori accessibili, specialmente quelli che hanno confini imprecisi o causano recidive di cellule neoplastiche adiacenti.In questo scenario, i meccanismi di riconoscimento di virus e tossine offrono un'interessante alternativa.Questi sistemi naturali si sono evoluti nel corso di milioni di anni per perfezionare i loro meccanismi di targeting, ingresso cellulare e infezione che legano recettori specifici con affinità nanomolari.10,11 Inoltre, manipolano in modo efficiente la risposta delle loro cellule ospiti utilizzando semplici segnali molecolari che attivano comportamenti cellulari programmati .È interessante notare che alcuni dei meccanismi di ingresso cellulare utilizzati da questi sistemi naturali possono anche aggirare la via di ingresso endo-lisosomiale "canonica" mediata dal recettore per prevenire la loro degradazione o esocitosi.Nella ricerca di nuove vie di ingresso cellulare mediate da recettori che aggirano la via canonica vescicolare endo-lisosomiale, abbiamo deciso di studiare la tossina Shiga (ShTx) come ligando proteico.12 Questa tossina, prodotta da Shigella dysenteriae e alcuni ceppi di Escherichia coli , è una proteina che riconosce specificamente la globotriaosilceramide (GB3 o CD77).13 Il meccanismo di riconoscimento e invasione delle cellule ShTx è uno dei sistemi più noti di dirottamento procariotico della risposta eucariotica.14 La tossina penetra nel citoplasma delle cellule bersaglio bypassando la via endolisosomiale, evitando così l'esposizione a mezzi lisosomiali enzimatici e acidi che distruggerebbero la tossina e, nel nostro caso, gli agenti terapeutici.15 È interessante notare che diversi studi hanno localizzato il recettore ShTx in cellule tumorali di diversa origine.13,16-20 Questo glicosfingolipide, arricchito in microdomini di membrana noti come zattere lipidiche, è sovraespresso in molte cellule tumorali umane multiresistenti ed è, quindi, moltorecettore interessante per il trattamento delle neoplasie maligne.Tra tutti i tumori localizzati e accessibili, ci siamo concentrati sul carcinoma a cellule squamose della testa e del collo (HNC).Ciò include una grande eterogeneità di tumori che originano dalle superfici mucose del cavo orale, difficili da trattare e tipicamente caratterizzati da recidive spesso fatali.In effetti, questa è la sesta forma più comune di cancro,21,22 con tassi di sopravvivenza di circa il 40-50% cinque anni dopo la diagnosi.23,24 Questo tumore viene generalmente rimosso chirurgicamente e quindi trattato con radioterapia adiuvante o chemioradioterapia.21 Tuttavia, le recidive fatali sono molto comuni a causa della scarsa individuazione delle aree preneoplastiche, della scarsa rimozione del tessuto interessato e della scarsa penetrazione del farmaco sistemico nella massa tumorale.Riteniamo che l'HNC sia un chiaro esempio di tumore maligno localizzato eterogeneo che potrebbe beneficiare in modo significativo del trattamento locale con nanomedicine mirate sia per la diagnosi che per il trattamento.È interessante notare che studi precedenti hanno stabilito che GB3 è un marker per cellule HNC preneoplastiche e maligne.18 Pertanto, dato che questo tipo di cancro consente l'applicazione topica di nanomateriali, la nostra ipotesi è di utilizzare nanoparticelle dirette da ShTxB come trattamento locale per evitare possibili tossicità sistemica.In questo studio, abbiamo ingegnerizzato geneticamente un'innocua proteina ligando basata su ShTx per la coniugazione con nanotubi d'oro (AuNR) per identificare e uccidere le cellule HNC preneoplastiche e maligne mediante fotoipertermia locale.ShTxB:6xIl suo costrutto genico ricombinante è stato sintetizzato da General Biosystems, Inc. (Morrisville, USA) (Figura S1) ed è stato clonato in sistemi plasmidici pET-15b (Novagen, Merck KGaA, Spagna).Le cellule One Shot™ BL21 (DE3) E. coli (NZYTech, Portogallo) sono state trasformate con il vettore di espressione.Le colture batteriche sono state coltivate in brodo Luria-Bertani (LB) integrato con 100 μg/mL di ampicillina e 35 μg/mL di cloramfenicolo fino a A600 ca.0.6.L'espressione della proteina è stata indotta aggiungendo 0,1 mM di isopropil bD thiogalactopyranoside (IPTG).Le cellule sono state raccolte dopo 4 ore mediante centrifugazione e risospese in NaPi 50 mM, NaCl 300 mM, pH 8,0 con lisozima 1 mg/mL e inibitori della proteasi (Pierce, Thermo Fischer, Spagna).I lisati di cellule batteriche sono stati ottenuti mediante sonicazione della sonda (impulsi 5 × 15s a 130 W, 65% di ampiezza, con intervalli di 15s, a 4 ℃) e il materiale insolubile è stato rimosso mediante centrifugazione.Il lisato proteico solubile batterico è stato caricato su colonne Ni-TED pre-equilibrate (Protino® Ni-TED, Macherey-Nagel GmbH & Co., Düren, Germania).La proteina ricombinante marcata con His è stata eluita in un tampone integrato con 250 mM di imidazolo.Infine, sono state utilizzate colonne di dissalazione PD-10 (GE Healthcare, Chicago, USA) per rimuovere l'imidazolo e per scambiare il tampone con PBS.I nanotubi d'oro (AuNR) in CTAB (cetiltrimetilammonio bromuro) sono stati sintetizzati utilizzando l'acido salicilico come additivo come precedentemente descritto.25,26 Per rivestire gli AuNR con silice, il CTAB sulla superficie è stato scambiato con mPEG-SH.L'eccesso di CTAB è stato lavato mediante centrifugazione ripetuta, gli AuNR sono stati risospesi in acqua Milli-Q ed è stata aggiunta goccia a goccia una soluzione di mPEG-SH (50 molecole/nm2).Dopo 1 ora di agitazione gli AuNR sono stati lavati e infine ridispersi in etanolo.Il rivestimento di silice è stato eseguito miscelando AuNR ([Au] = 0,5 mM) con la quantità appropriata di H2O (10,55 M), NH3 (0,2 M) e soluzione di tetraetil ortosilicato (TEOS) (1 mM) e consentendo la reazione per 6 ore a temperatura ambiente (RT).27 Il fluoroforo Rodamina B isotiocianato (RBITC) è stato coniugato con APMS e aggiunto nelle successive fasi di ricrescita del guscio consentendo la sua coniugazione con SiO2.28 Gli AuNR rivestiti di fluorescenza sono stati lavati mediante ripetuti cicli di centrifugazione/ridispersione in etanolo.Tutti i reagenti sono stati ottenuti da Sigma-Aldrich, ad eccezione dell'etanolo (96%) che è stato acquistato da Scharlab.I nanotubi dispersi in etanolo sono stati adsorbiti su una griglia di rame Lacey (400 mesh, risoluzioni EM) e caratterizzati utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione JEM 1011 (JEOL) (TEM) (Figura S2).I nanotubi sono stati funzionalizzati con 0,5 mg/mL della soluzione proteica (quantità di saturazione) in PBS durante una lieve sonicazione 3×2 s a temperatura ambiente.Per SDS-PAGE, la proteina funzionalizzata sulle particelle è stata rimossa utilizzando il tampone campione Laemmli 1 × (BioRad) a 90 ° C per 2 minuti.L'elettroforesi SDS-PAGE è stata eseguita utilizzando gel prefabbricati Mini-Protean® (BioRad).L'analisi delle proteine ​​è stata eseguita su gel colorati di Coomassie che sono stati scansionati utilizzando il sistema BioRad GelDoc EZ.Le cellule Detroit 562, cellule di carcinoma epiteliale della faringe umana derivate da un versamento pleurico metastatico, e MCF-7, cellule di carcinoma mammario umano, sono state ottenute da ATCC Ref.CCL-138 e HTB-22 rispettivamente.Le cellule Detroit 562 sono state coltivate in Modified Eagle's Medium e cellule MCF-7 in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Sigma) contenente il 10% di siero bovino.Entrambe le linee cellulari sono state mantenute in condizioni standard.Le cellule MCF7 sono state utilizzate come controlli (GB3-ve) dopo la caratterizzazione con l'anticorpo anti-GB3 (Figura S4).Un totale di 500.000 cellule sono state lavate, tripsinizzate e centrifugate a 1000 rpm per 5 minuti.Il supernatante è stato rimosso e i pellet sono stati risospesi in 50 μL di terreno di coltura per creare un pellet cellulare che è stato utilizzato come microtumore.Le cellule sono state esposte a 5 µg/mL di particelle bioconiugate [email protected]2:[email protected] per 3 ore.Le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4%, colorate con Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich®), Acridine Orange (Sigma-Aldrich®) per le cellule vive o bromuro di etidio (Sigma) per le cellule morte.Alexa647-anti-Human CD77 (BD Pharmingen™, UK) è stato utilizzato per l'immunocolorazione del recettore GB3.Le immagini confocali sono state scattate con un microscopio Nikon A1R.Tutte le immagini fluorescenti sono pseudo-colorate.I campioni di cellule processati per la microscopia elettronica sono stati fissati con glutaraldeide al 3% in PBS 0,12 M per 24 ore e sono stati post-fissati in tetrossido di osmio tamponato al 2%, disidratati in una serie di acetone graduato e incorporati in Araldite.Sezioni ultrasottili di ca.70 nm di spessore, sono stati ottenuti su un ultramicrotomo LKB, colorato con citrato di piombo e acetato di uranile.TEM è stato eseguito utilizzando un JEOL JEM 1011 operato a 100 kV.Gli esperimenti di quantificazione della morte cellulare sono stati eseguiti con un totale di 106 cellule Detroit e MCF-7.Le cellule sono state colorate con il kit Annexin V-FITC (Immunostep) per 15 minuti.e poi passato attraverso il citometro (CytoFLEX, Beckman Coulter).L'espressione quantitativa di GB3 è stata convalidata e misurata in un totale di 10.000 cellule Detroit e MCF-7 immunocolorate con Alexa647-anti-Human CD77 (BD Pharmingen™, Regno Unito) per 30 minuti e quindi fissate in paraformaldeide al 4% (Figura S4).L'interazione qualitativa di [email protected] 2@ShTxB nelle celle è stata eseguita utilizzando 10.000 celle Detroit 562 e MCF-7.Le cellule sono state esposte alle nanoparticelle per 3 ore, lavate e passate attraverso il citometro.I dati sono stati analizzati utilizzando il software CytExpert.Gli esperimenti in vivo sono stati progettati ed eseguiti per ridurre al minimo l'uso di animali.I permessi etici per questo studio sono stati richiesti, approvati e ottenuti dal Comitato di Bioetica dell'Università della Cantabria, Direzione Generale del Bestiame, Governo della Cantabria (Rif. Progetto PI-11-21).I topi C57BL/6 (12 settimane femmina/maschio di 20-25 mg di peso) sono stati alloggiati con un ciclo luce/buio di 12 ore con fornitura gratuita di cibo e acqua presso il Servizio Sperimentazione (SEEA) dell'Università della Cantabria.Gli animali sono stati mantenuti, manipolati e sacrificati secondo la direttiva 2010/63/UE.Il modello preclinico di carcinogenesi orale è stato prodotto utilizzando il carcinogeno 4-Nitro-quinoline-1-oxide (4-NQO, Sigma Aldrich) come precedentemente descritto.29-31 In breve, a 12 topi è stata offerta acqua potabile con 100 μg/mL di 4-NQO per 16 settimane (l'acqua è stata cambiata una volta alla settimana).Dopo 16 settimane di trattamento, i topi con lesioni visibili nella cavità orale sono stati trattati con 5 µg/mL di [email protected]2@ShTxB nell'acqua da bere (circa 1 mg/kg di topi in totale) per 24 ore prima del sacrificio.Per l'irradiazione laser, 6 topi sono stati umanamente sacrificati ei tessuti sono stati sezionati e immediatamente irradiati come indicato nel testo.La procedura di irradiazione è stata eseguita una sola volta.I tessuti sono stati fissati in formalina al 10%, incorporati in paraffina, sezionati (4 μm di spessore), deparaffinati, colorati con ematossilina-eosina o conservati in un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) a -80 ℃ per essere criosezionati.Sezioni criostatiche di circa 6 μm sono state fissate in paraformaldeide al 4%, immunocolorate con Alexa 647-anti-Human CD77 (BD Pharmingen™, Regno Unito) e con Hoechst.Le autorizzazioni etiche per questo studio sono state richieste, approvate e ottenute dal Comitato etico per la ricerca clinica del Consiglio della Cantabria, Spagna (Rif. 2017.259).Lo studio è conforme alla Dichiarazione di Helsinki.In tutti i casi, il materiale di tessuto umano scartato dopo l'intervento chirurgico è stato ottenuto con il consenso scritto presentato dai medici al paziente ed è stato trattato in modo anonimo.Le colture cellulari dei campioni di biopsia sono state coltivate da biopsie di tumori maligni localizzati al pavimento della bocca (MASCC, moderatamente aggressivo, grado intermedio) e trigono retromolare (ASCC, alto grado, aggressivo).Il grado di aggressività è stato caratterizzato dal clinico.Le cellule di controllo sono state isolate da una biopsia umana sana (mucosa interna della guancia).Le biopsie sono state tagliate a pezzi e lavate due volte con PBS-EDTA, 100 U/mL di penicillina-streptomicina (Pen/Strep) e 0,5 μg/mL di amfotericina B. I pezzi sono stati poi lavati due volte con 1x PBS, 100 U/mL di Pen/Strep e 0,5 μg/mL di amfotericina B e incubato con agitazione a 37 °C per 4 cicli di 15 min con 0,075% di tripsina, 2,5 mg/mL di collagenasi P, 1 × PBS, 100 U/mL Pen/Strep e 0,5 μg/mL di amfotericina B. I cheratinociti isolati sono stati co-coltivati ​​con uno strato di alimentazione di (3T3)-J2 strato di alimentazione di fibroblasti di topo (precedentemente inattivato con mitomicina C).HNSCC e cheratinociti primari sani sono stati coltivati ​​in un terreno Rheinwald FAD modificato.32,33 3:1 v/v Dulbecco's Modified Eagle Medium – Ham's F12, 5% siero bovino fetale, 0,5 μg/mL di idrocortisone, fattore di crescita epidermico 5 ng/mL , tossina colerica 9 ng/mL, adenina 1,8×10−4, insulina 5 µg/mL, L-glutammina 2 mM, piruvato di sodio 0,75 mM e Pen/Strep 100 U/mL.La linea cellulare di fibroblasti di topo 3T3-J2 utilizzata come strato di alimentazione è stata coltivata in terreno Dulbecco con siero di vitello donatore al 10% e 100 U/mL Pen/Strep.Le cellule Detroit 562 e MCF-7 di controllo sono state esposte a 5 µg/mL e 10 µg/mL di [email protected]2@ShTxB per 3 ore.Quindi le cellule sono state lavate, pellettate in microtumori e irradiate con un laser NIR non focalizzato (808 nm LD, 1 W) per 10 min.Dopo l'irradiazione, le cellule sono state riposte nelle piastre di coltura nell'incubatore per altre 24 ore.Dopo questo periodo, le cellule sono state colorate con un kit per l'apoptosi delle cellule morte con AnnexinV-FITC e PI, per l'analisi citometrica a flusso e la microscopia confocale a 0 e 24 ore.Le colture di cellule neoplastiche o normali da cellule di biopsie orali sono state trattate con 5 µg/mL [email protected]2@ShTxB per 3 ore.Dopo la rimozione delle particelle nel mezzo, le colture sono state irradiate con 808 nm LD per 10 minuti direttamente sulla piastra.Irradiazione del tumore in vivo: una volta che le lesioni cancerose verrucose erano visibili nella cavità orale, ai topi è stata fornita acqua contenente 10 μg/mL delle particelle [email protected]2:[email protected] per 12 ore.I topi sono stati soppressi e le lingue sezionate e fotografate.Questi tessuti sono stati irradiati con un laser a 808 nm per 5 minuti.I tessuti sono stati quindi elaborati e sezionati per l'analisi.L'analisi statistica del test t di Student è stata utilizzata per l'analisi statistica e per valutare la significatività stabilita per un *p <0,025 o un **p <0,005.I risultati quantitativi sono espressi come valori medi con le corrispondenti barre di errore standard.Queste analisi statistiche sono state eseguite utilizzando SPSS, versione 19.0.La ShTx appartiene alla famiglia delle tossine AB5 secrete da alcuni batteri patogeni (Figura 1A).34 Tutte queste tossine condividono una struttura simile e seguono meccanismi identici per entrare nelle cellule bersaglio.Dal punto di vista strutturale, ShTx è composto da 6 (1+5) polipeptidi (Figura 1A).La subunità "A" è la subunità catalitica che, dopo l'internalizzazione, interferisce con le normali funzioni della cellula ospite.Il resto della tossina comprende cinque copie identiche della subunità "B", che si assemblano in un omopentamero che circonda la subunità "A".Ciascuna subunità "B" può contattare il recettore sulla membrana della cellula bersaglio innescando il raggruppamento al momento dell'accoppiamento, provocando così l'increspatura della membrana.12,34-37Figura 1 (A) Struttura della tossina Shiga (ShTx).La struttura prevista della proteina ligando simile a ShTxB ingegnerizzata.Un singolo dominio B (ShTxB) (blu) è attaccato alla coda cationica 6xHis (rossa).(B) Immagini TEM di AuNR prima e dopo il rivestimento SiO2.(C) Diagramma dei passaggi sintetici per la produzione di [email protected]2@ShTxB.Creato con BioRender.com.(D) Gel SDS-PAGE colorati con Coomassie che mostrano (n. 1) sovraespressione proteica ShTxB-ligando ricombinante, (n. 2) ShTxB purificato e (n.Figura 1 (A) Struttura della tossina Shiga (ShTx).La struttura prevista della proteina ligando simile a ShTxB ingegnerizzata.Un singolo dominio B (ShTxB) (blu) è attaccato alla coda cationica 6xHis (rossa).(B) Immagini TEM di AuNR prima e dopo il rivestimento SiO2.(C) Diagramma dei passaggi sintetici per la produzione di [email protected]2@ShTxB.Creato con BioRender.com.(D) Gel SDS-PAGE colorati con Coomassie che mostrano (n. 1) sovraespressione proteica ShTxB-ligando ricombinante, (n. 2) ShTxB purificato e (n.Le subunità ShTx "B" sono ligandi naturali GB3 innocui ad alta affinità12,38 che sono stati utilizzati con successo per guidare con successo fluorofori,39,40 radionuclidi,41 farmaci,16,42 o persino nanoparticelle17 al citoplasma di GB3 positivo (GB3+ve) cellule.Alla luce di questi risultati, abbiamo proposto di utilizzare questo frammento della proteina ShTx come ligando per indirizzare nanomateriali fotoattivabili multifunzionali a cellule di carcinoma squamoso GB3 positivo (GB3 + ve).Per rimuovere la parte catalitica della proteina e prevenire la morte cellulare non specifica, abbiamo ingegnerizzato geneticamente una nuova proteina che conteneva solo il dominio B di legame al recettore della tossina. Questo frammento di tossina è stato geneticamente fuso con un peptide cationico.Ciò consente la funzionalizzazione elettrostatica con la superficie negativa delle particelle rivestite di silice come precedentemente descritto.17,43 Inoltre, questo metodo consente di posizionare il dominio del ligando della proteina correttamente orientato sulla superficie della nanoparticella (Figura 1A).43 Inoltre, questo Il metodo di funzionalizzazione riduce anche il biofouling proteico non specifico ed è molto stabile all'esposizione a condizioni fisiologiche (> 72 h). P09386) era geneticamente legato al suo C-terminale a un tag hexahistidine (6xHis).La proteina ShTxB è stata sovraespressa per la produzione in batteri e purificata utilizzando colonne di affinità (sezione sperimentale) (figura S1).Per distruggere le cellule cancerose per via topica abbiamo progettato nanomateriali in grado di produrre ipertermia in seguito all'illuminazione laser.Tra l'ampia varietà di nanomateriali plasmonici disponibili, gli AuNR sono senza dubbio il sistema più comunemente utilizzato,44 a causa dei loro metodi di sintesi riproducibili e versatili e delle risonanze plasmoniche di superficie localizzate (LSPR) sintonizzabili.45 Per il presente studio, abbiamo sintetizzato AuNR con dimensioni di ca.55 nm x 13 nm (Figure 1B e S2), risultante in una banda LSPR longitudinale centrata a 803 nm, risonante con un diodo laser a 808 nm, all'interno della prima finestra biologica.I dettagli del protocollo di sintesi possono essere trovati altrove.44 Ai fini della localizzazione in cellulo, gli AuNR sono stati rivestiti con ca.Guscio di silice amorfa macchiato di 35 nm di isotiocianato di rodamina B (RBITC) ([email protected]2) (Figura 1B), preparato seguendo la procedura descritta in precedenza.28 Prima dell'attivazione, le particelle risultanti [email protected]2:RBTIC non mostravano alcuna tossicità rilevabile a dosaggi di 5-15 µg/mL se applicato al carcinoma epiteliale della faringe umana dopo 96 ore (Figura S3).Il progetto è stato finalizzato dalla biofunzionalizzazione del [email protected] 2:RBTIC con uno strato di proteina ligando ShTxB (Figura 1C).La bioconiugazione delle nanoparticelle è stata effettuata mediante incubazione in una soluzione da 0,5 mg/mL di ShTxB:6xHis proteina prodotta nei batteri e successivamente purificata seguendo procedure standard (vedere i dettagli nelle Informazioni supplementari).La presenza di ShTxB sulla superficie [email protected]2:RBTIC è stata convalidata biochimicamente dall'analisi SDS-PAGE (Figura 1D e S1B).Per determinare l'affinità del funzionalizzato [email protected]2:[email protected] per le cellule HNC recanti il ​​recettore GB3, abbiamo scelto le cellule Detroit 562 dal carcinoma epiteliale della faringe umana derivato da un versamento pleurico metastatico.Come controlli negativi, abbiamo utilizzato cellule di cancro al seno umano MCF-7 prive del recettore GB3 (GB3-ve).La conferma della presenza/assenza del recettore in entrambi i modelli cellulari è stata studiata mediante immunocolorazione con anticorpi anti-GB3 utilizzando due tecnologie, citometria a flusso e microscopia confocale (Figura S4).Dopo la convalida dei modelli, abbiamo testato l'affinità dei nanoconiugati per le cellule neoplastiche.Per fare ciò, le colture 2D dei due tipi di cellule sono state esposte in parallelo a 5 µg/mL di nanoparticelle funzionalizzate con ShTxB nei terreni di coltura per 2 ore.In questo momento, le cellule sono state fissate ed elaborate per la citometria a flusso per la quantificazione dei nanotubi funzionalizzati catturati (Figura 2A).Abbiamo scoperto che, rispetto ai controlli (<2% di cellule contenenti nanotubi), oltre il 90% delle cellule HNC GB3 + ve (Detroit 562) ha catturato nanoparticelle durante questo periodo di incubazione.Questa scoperta è stata successivamente convalidata utilizzando la microscopia confocale.La Figura 2B mostra come, due 2 ore dopo l'incubazione delle nanoparticelle con le cellule, i nanotubi co-localizzati con la membrana citoplasmatica presumibilmente accoppiati con i recettori GB3 raggruppati (frecce arancioni).Questo risultato è stato supportato anche da immagini TEM di sezioni ultrasottili delle cellule (Figura 2C e D).Insieme, questi dati supportano l'ipotesi che i nanotubi rivestiti con ShTxB interagiscano in modo efficiente con i recettori GB3 sulle cellule HNC che penetrano nel citoplasma cellulare di queste cellule neoplastiche (Figura 2D).Figura 2 [email protected]:[email protected] selettività cellulare.(A) Quantificazione della citometria a flusso dell'interazione di [email protected]2:[email protected] con cellule di controllo (GB3-ve) e HNC (GB3+ve).Le cellule sono state esposte alle nanoparticelle per 2 ore e quindi lavate prima della fissazione e dell'analisi della citometria a flusso.Creato con BioRender.com.(B) Immagine con microscopia confocale a singolo piano Z di cellule neoplastiche HNC umane esposte a 5 g/mL di [email protected]2:[email protected] (canale rosso) e live immunostained per GB3 (canale verde).I nanotubi raggruppati colocalizzano con i recettori GB3 sulla superficie cellulare (frecce arancioni).(C e D) Immagini TEM di sezioni ultrasottili di cellule neoplastiche HNC incubate con [email protected]2:[email protected] Gli AuNR contattano la superficie cellulare (freccia rossa).(C) Le particelle inghiottite appaiono in grandi strutture membranose irregolari vicino al bordo cellulare o nel citosol in prossimità delle membrane citoplasmatiche.Alcuni AuNR possono essere osservati liberi nel citosol (freccia bianca).(D) Immagine di un'intera cellula GB3 + ve HNC in cui le nanoparticelle funzionalizzate possono essere trovate sia in una struttura membranosa (freccia vuota), sia libere nel citoplasma (freccia piena).Figura 2 [email protected]:[email protected] selettività cellulare.(A) Quantificazione della citometria a flusso dell'interazione di [email protected]2:[email protected] con cellule di controllo (GB3-ve) e HNC (GB3+ve).Le cellule sono state esposte alle nanoparticelle per 2 ore e quindi lavate prima della fissazione e dell'analisi della citometria a flusso.Creato con BioRender.com.(B) Immagine con microscopia confocale a singolo piano Z di cellule neoplastiche HNC umane esposte a 5 g/mL di [email protected]2:[email protected] (canale rosso) e live immunostained per GB3 (canale verde).I nanotubi raggruppati colocalizzano con i recettori GB3 sulla superficie cellulare (frecce arancioni).(C e D) Immagini TEM di sezioni ultrasottili di cellule neoplastiche HNC incubate con [email protected]2:[email protected] Gli AuNR contattano la superficie cellulare (freccia rossa).(C) Le particelle inghiottite appaiono in grandi strutture membranose irregolari vicino al bordo cellulare o nel citosol in prossimità delle membrane citoplasmatiche.Alcuni AuNR possono essere osservati liberi nel citosol (freccia bianca).(D) Immagine di un'intera cellula GB3 + ve HNC in cui le nanoparticelle funzionalizzate possono essere trovate sia in una struttura membranosa (freccia vuota), sia libere nel citoplasma (freccia piena).La morfologia degli AuNR è stata progettata per indurre il riscaldamento mediante illuminazione con un LD di 808 nm, coincidente con la prima finestra biologica.Per questi studi, le cellule HNC sono state esposte a [email protected] 2@ShTxB per 2 ore, sono state lavate e quindi raccolte in pellet di circa 2 mm simili a microtumori solidi (vedere il disegno sperimentale nella Figura 3A).Questi sono stati irradiati per 3 o 10 minuti con una fibra LD sfocata da 1 W a 808 nm, in risonanza con l'LSPR longitudinale degli AuNR.Dopo l'irradiazione, le cellule sono state immediatamente riseminate e lasciate crescere per 24 ore prima della quantificazione viva/morta mediante citometria a flusso (Figura 3A).Figura 3 Eliminazione selettiva delle cellule tumorali HNC con [email protected] 2@ShTxB dopo l'irradiazione.(A) Diagramma della procedura sperimentale.Creato con BioRender.com.(B) Quantificazione di cellule vive/morte 24 ore dopo l'irradiazione in cellule di controllo (GB3-ve) e HNC (GB3+ve) mediante colorazione con AnnexinV-FITC/PI e citometria a flusso (Figura S4).Le celle morte vengono visualizzate nella cornice in alto a destra del grafico.(C) Percentuali medie di vitalità cellulare dopo irradiazione LD a microtumori (circa 10.000 cellule misurate per esperimento; n = 3; * Per un * p <0,025 o un *** p <0,005.Figura 3 Eliminazione selettiva delle cellule tumorali HNC con [email protected] 2@ShTxB dopo l'irradiazione.(A) Diagramma della procedura sperimentale.Creato con BioRender.com.(B) Quantificazione di cellule vive/morte 24 ore dopo l'irradiazione in cellule di controllo (GB3-ve) e HNC (GB3+ve) mediante colorazione con AnnexinV-FITC/PI e citometria a flusso (Figura S4).Le celle morte vengono visualizzate nella cornice in alto a destra del grafico.(C) Percentuali medie di vitalità cellulare dopo irradiazione LD a microtumori (circa 10.000 cellule misurate per esperimento; n = 3; * Per un * p <0,025 o un *** p <0,005.Lo studio ha rivelato che un'esposizione laser di 3 minuti era sufficiente per uccidere ca.50% delle cellule neoplastiche GB3+ve che contenevano [email protected] 2@ShTxB (Figura 3B).Periodi di irradiazione più lunghi (10 min) eliminati ca.80% delle cellule HNC (Figura 3C).Al contrario, le cellule GB3-ve di controllo trattate in parallelo non sono state quasi influenzate dall'esposizione a nanomateriali e radiazioni laser.(Figura 3B).Come complemento, abbiamo anche studiato questo effetto in colture multistrato 2D di cellule neoplastiche HNC.Seguendo l'esperimento illustrato nella Figura 4A, abbiamo incubato colture di cellule Detroit 562 con [email protected] 2@ShTxB (5 g/mL per 3 h) ed esposto le colture a un'irradiazione laser non focalizzata di 808 nm per 10 min.La figura 4B mostra come, circa 1 h dopo l'irradiazione, le cellule morte (colorate in rosso) appaiono nell'area trattata (cerchio giallo).Le cellule morte si staccano progressivamente dal substrato di coltura, lasciando un'area priva di cellule chiaramente visibile 24 ore dopo l'irradiazione.Il ritardo nell'insorgenza della morte cellulare ha suggerito l'attivazione di processi a cascata di morte innescati dall'interno verso l'esterno, suggerendo l'apoptosi (vedi Figura 3B).Questo processo di morte cellulare è più desiderabile della necrosi che normalmente si innesca quando le cellule vengono bruscamente distrutte con il calore utilizzando fonti esterne o quando le nanoparticelle perforano la membrana citoplasmatica.Come previsto, non è stata rilevata alcuna morte cellulare nelle colture irradiate senza nanoparticelle o trattate con nanoparticelle ma non laser (Figura S5A).Nell'esperimento, la temperatura nel mezzo di coltura è stata misurata durante l'irradiazione e non sono stati osservati cambiamenti significativi (Figura S5B).Tutti i diritti riservati.Registrato in Inghilterra e Galles.